Originalmente, los métodos de monocristal, con giro amplio de la muestra, como los mencionados anteriormente, se impusieron por su facilidad de interpretación. Sin embargo, cuando se llegó a experimentar con redes directas grandes, es decir, recíprocas pequeñas, los tiempos de recogida se disparaban y por lo tanto se recurrió al método de oscilación con ángulos pequeños, que permitía recoger varios niveles recíprocos a la vez sobre cada posición del cristal. Repitiendo estos diagramas, a distintas posiciones de partida del cristal, se conseguían obtener suficientes datos en un tiempo razonable. La geometría de recogida está descrita en las figuras que vienen a continuación.
Hoy en día, con generadores de ánodo rotatorio o sincrotrones, y detectores de área (image plate ò CCD, ver más abajo), que aumentan la intensidad de los máximos de difracción y reducen los tiempos de recogida con gran fiabilidad, se ha impuesto este método para los estudios de macromoléculas, en particular de proteínas.
Esquema de la geometría de las condiciones de máximo de difracción en el método de oscilación. El cristal, y por tanto la red recíproca, están oscilando un pequeño ángulo alrededor de un eje perpendicular al plano de la figura y que pasa por el centro. En la figura de la derecha, el área que pasa por condición de máximo de difracción está denotada por el área amarillenta, delimitada por la esfera de Ewald (de radio 2.sen 90/λ) en los dos extremos de oscilación de la red, y la esfera de resolución máxima (de radio 2.sen θmax/λ) que se puede alcanzar con la radiación empleada y con el detector que se haya usado.
Cuando la red recíproca oscila un pequeño ángulo, alrededor del eje de giro, pequeñas zonas de los diferentes niveles de la red recíproca entran en contacto con la esfera de Ewald, alcanzando las condiciones de máximo de difracción. De este modo, sobre la pantalla del detector, la geometría de oscilación produce máximos de difracción procedentes de diferentes niveles de la red recíproca y formando lúnulas sobre el diagrama (figura de la derecha)
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Goniometría de cuatro círculos
La introducción de los computadores digitales a finales de la década de 1970, permitió el diseño de los llamados difractómetros automáticos de cuatro círculos. Estos equipos, disponen de un sistema goniométrico, con una mecánica muy precisa, que mediante tres giros permite colocar el cristal en cualquier orientación del espacio, provocando así que se cumplan los requerimientos de la construcción de Ewald para que se produzca la difracción. En estas condiciones, un cuarto eje de giro, que sustenta el detector electrónico se coloca en condiciones de recoger el haz difractado. Todos estos movimientos se pueden programar para que se realicen de un modo automático, con una mínima intervención del operador.
Entre este tipo de goniómetros se pueden distinguir dos geometrías goniométricas que se han usado con excelente éxito durante muchos años. En el goniómetro de geometría Euleriana (ver figura de abajo) el cristal se orienta mediante los tres ángulos de Euler, Φ que representa el giro sobre el eje de la cabeza goniométrica, χ que le permite el balanceo sobre el círculo cerrado, y ω que permite el giro total del goniómetro. El cuarto círculo lo representa el giro del detector, 2θ. Esta geometría, presenta la ventaja de la estabilidad mecánica, pero por contra restringe la accesibilidad al cristal para equipos externos de baja o alta temperatura.
Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Euleriana
Movimientos de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Euleriana
(Si no observa movimiento, por favor, recarge la página)
La geometría alternativa a la Euleriana es la denominada geometría Kappa que no dispone de un círculo cerrado equivalente al χ. En su lugar, su función la cumplen los llamados ejes κ (kappa) y ωκ, de tal modo que con una combinación de ambos se pueden obtener χ eulerianos en el intervalo de -90 a +90º. La ventaja principal de esta geometría es la amplia accesiblidad al cristal. Los ángulos Φ y 2θ son idénticos al los de la geometría euleriana:
Esquema y aspecto de un goniómetro de cuatro círculos con geometría Kappa.
Tanto en la geometría Euleriana como Kappa, el sistema de detección ampliamente usado durante muchos años es el denominado "puntual", en el sentido de que la detección de cada haz difractado (reflexión) se realiza de modo individual, necesitando cambiar, de modo automático y programado, los cuatro valores angulares del goniómetro para cada haz difractado. Los tiempos de medida en estos equipos suele ser del orden de 1 minuto por reflexión.
Uno de los detectores más ampliamente usados ha sido el denominado detector de centelleo, cuyo esquema de funcionamiento es el siguiente:
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Detectores de área
Como alternativa a los detectores "puntuales", el desarrollo de la tecnología electrónica ha dado lugar a la aparición de los denominados detectores de área, que permiten la detección de muchos haces de difracción simultáneamente, ahorrando con ello tiempo en el experimento. Esta tecnología es de especial utilidad para el caso de las proteínas y en general de cualquier material que pueda deteriorarse durante su exposición a los rayos X, ya que la detección de cada una de las imágenes que se recogen (con varios cientos o miles de reflexiones) se hace en un tiempo mínimo, del orden de los segundos.
Uno de los detectores de área mas comunmente usado se basa en los denominados CCD's (del inglés Charge Coupled Device) cuyo esquema se muestra a continuación:
Esquema de un CCD con indicación de sus componentes principales.El conversor de rayos X (D en la figura) es un material sensible, del tipo P, GdOS, etc., que es capaz de convertir los rayos en pulsos eléctricos. Los CCD's operan a una gran velocidad de conversión, aunque su desventaja es la de operar a muy bajas temperaturas (del orden de -70 ºC).
Los detectores del tipo CCD se instalan normalmente sobre equipos goniométricos con geometría Kappa y por su rapidez su uso está ampliamente extendido en el ámbito de la Cristalografía de proteínas, asociados a generadores de ánodo rotatorio o en las grandes instalaciones de sincrotrón.
Goniómetro de geometría Kappa con detector tipo CCD.
(Imagen tomada de Bruker-AXS)
Detalle del montaje de un goniómetro con geometría Kappa (aunque con ángulo κ fijo)
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Otro tipo de detectores de amplio uso hoy en día, especialmente en la Cristalografía de proteínas es el llamado Image Plate Scanner que generalmente se montan sobre un goniómetro relativamente rudimentario, cuya única libertad de giro corresponde a la del cristal sobre su eje de montaje. El detector propiamente dicho es una placa circular de material sensible a los rayos X que se interpreta, después de la exposición, mediante un laser capaz de digitalizar las intensidades.
Image Plate Scanner.
(Imagen tomada de Mar Research)
Detalle de un detector del tipo Image Plate Scanner
La recogida de un espectro completo consiste en la obtención de multitud de imágenes como la que se muestra más abajo, y que posteriormente son analizadas para obtener la métrica, simetría e intensidades del espacio recíproco.
Aspecto de una de las imágenes de difracción, del tipo oscilación, de una proteína recogida en un Image Plate Scanner. Durante la exposición de cada una de estas imágenes (unos 5-10 minutos con un generador de ánodo rotatorio, o de varios segundos en una instalación de sincrotrón) el cristal gira aproximadamente 0.5º y la lectura de la imagen dura unos 30 segundos.
Este podría ser también el aspecto de una imagen de difracción recogida en un detector de tipo CCD, aunque en este caso probablemente la duración de la exposición habría sido algo más corta. Colección de imágenes de difracción consecutivas obtenidas en detectores de tipo Image Plate Scanner o CCD
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En todas estas metodologías (excepto en el caso del método de Laue), la radiación que se utiliza suele ser monocromática (o casi), es decir, que es una radiación X que contiene exclusivamente (o casi) una única longitud de onda, y para ello se suelen utilizar los llamados monocromadores, compuestos por un sistema de cristales que, basándose en la ley de Bragg, son capaces de "filtrar" (por el propio proceso de difracción) la radiación policromática y "dejar pasar" sólo una de las longitudes de onda (color), tal como se muestra en la figura de abajo:
Esquema de un monocromador. Una radiación policromática (blanca) que llega por la izquierda (abajo) se "refleja" de acuerdo con la ley de Bragg, en distintas orientaciones del cristal, para dar lugar a una radiación monocromática que se vuelve a reflejar ("filtrar") en el segundo cristal.
Imagen tomada del ESRF.
En la actualidad, en los laboratorios de Cristalografía, o incluso en las nuevas líneas de radiación sincrotrón, los monocromadores tradicionales están siendo reemplazados por nuevos componentes ópticos que han demostrado una eficacia superior a los primeros. Estos componentes reciben el nombre genérico de "espejos" y pueden estar basados en los fenómenos de:
• reflexión total (espejos, capilares y guías de onda),
• refracción (lentes de refracción) y
• difracción (cristales, basados en la técnica del monocromador, y materiales en multicapas, etc.)
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Sistema de enfriamiento mediante nitrógeno líquido. Imagen tomada de Oxford Cryosystems
Con objeto de obtener el mayor y mejor conjunto de datos de la red recíproca se debe usar igualmente un equipo de enfriamiento de la muestra, que proporciona una corriente de nitrógeno seco a temperatura de unos 100 K (es decir aproximadamente a -170 ºC).
De este modo, los cristales (y especialmente los de macromoléculas) son más estables y resisten mejor la radiación X. Con ello se consigue, además, reducir los factores de vibración térmica de los átomos y por lo tanto facilitando su localización.
Para montar los cristales en el flujo de nitrógeno frío suelen usarse unos pequeños lazos que sirven para "pescar" el cristal en una matriz que sea transparente a los rayos X.
Esto es especialmente importante en el caso de los cristales de proteína, en los que dicha matriz es un crio-protector (anti-congelante) que se dispersa por los canales interiores del cristal y reemplaza las moléculas de agua por las del crio-protector; de no hacerse de este modo, la congelación del agua interna provocaría la ruptura del cristal.
Sistema de crioprotección montado en un goniómetro. La corriente de nitrógeno a -170 ºC llega por el conducto superior y enfría el cristal montado sobre una cabeza goniométrica que gira.
El colimador del haz de rayos X apunta hacia el cristal desde la izquierda de la imagen.
Obsérvese el ligero vapor que genera la corriente fría de nitrógeno cuando se mezcla con el aire húmedo del ambiente.
En resumen, todos estos métodos permiten obtener una colección de datos, formados por tres índices de Miller y una intensidad para cada uno de los máximos de difracción medidos. Con ello, se debe poder conseguir medir la mayor parte posible de la red recíproca, ponderada con intensidades, es decir, el espectro de difracción de un monocristal de la muestra a estudiar.
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Los datos de difracción nos permitirán reconstruir la arquitectura interior del cristal, pero eso será objeto de otro capítulo ...
Electrónica en Estado Solido
Greiner A. González R.
http://www.xtal.iqfr.csic.es/Cristalografia/parte_06.html
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